豬偽狂犬?。ˋD）作為我國豬場普遍存在的重要疫病之一，對養豬生產造成的負面影響和經濟損失不言而喻。在當前養豬場將非洲豬瘟和豬藍耳病作為防控重點的背景下，養殖者對豬偽狂犬病的重視程度有所降低，但豬偽狂犬病的防控和凈化依然是目前許多豬場面臨的一個不可忽視和回避的話題，尤其是種豬場，豬偽狂犬病陰性場仍是一塊金字招牌，不僅僅是豬群健康程度的體現，也是對公司實力的認同并對企業形象有所提升；從另一個角度來講，目前豬場生物安全普遍提高，為局域乃至全國豬偽狂犬病凈化提供了絕佳的機會。

在凈化道路上，如何選擇合適的能夠用于免疫評估AD-gB-ELISA的抗體試劑盒對豬群實時監控免疫狀態和感染壓力顯的尤為重要。下面結合AD-gB-ELISA抗體試劑盒的研發背景及臨床應用情況進行分析：

AD-gB-ELISA抗體試劑盒有兩種類型，一類是預警試劑盒，主要用于預警篩查；另一類是免疫評估試劑盒，主要用于疫苗免疫后的效果評估。

歐美研發生產上市ELISA抗體試劑盒的廠家開始于上世紀80年代、大多廠家成立于90年代，而在此期間甚至更早，歐美主要養豬國家（美國、加拿大、法國、德國、英國、荷蘭、丹麥等）早已凈化豬偽狂犬病，豬瘟、口蹄疫等傳染病同樣如此。在此地域和時代背景下，生產廠家研發了適用于本國動物疾病早期篩查預警的ELISA抗體試劑盒（如AD-gB-ELISA及CSF-E2-ELISA、FMD-SP-ELISA等），類似目前我國普遍應用的非瘟ELISA抗體試劑盒，不是用于疫苗免疫效果評估，而是用于篩查預警、早期“拔牙”，因此對試劑盒的敏感性要求較高即由感染到抗體轉陽要早發現是毋庸置疑。

在上世紀90年代后期，這些用于篩查預警的ELISA抗體試劑盒開始陸續被引進到中國，而中國是一個采用豬偽狂犬病（包括豬瘟、口蹄疫等）疫苗進行免疫的國家，因此普遍存在使用篩查預警的ELISA抗體試劑盒進行免疫效果評估并推廣應用的現象及誤區。

從整個疫病凈化角度而言，非免無疫是最終要實現的目的。歐美國家定期監測豬偽狂犬病野毒感染常采用AD-gB-ELISA試劑盒而非AD-gE-ELISA試劑盒，主要原因是在免疫無疫到非免無疫過渡階段，部分或個別豬場出于謹慎考慮，不愿意停止疫苗免疫接種，因此采用AD-gB-ELISA試劑盒不僅可以監測豬偽狂犬病野毒感染情況同時可以調查是否進行豬偽狂犬病疫苗免疫接種。

鑒于以上原因，國外常采用AD-gB-ELISA試劑盒進行初篩和預警，監督豬場停止疫苗免疫同時預警是否有ADV野毒感染存在，這是歷史原因造成的。正是由于這樣的原因，決定了國外的試劑盒首先要考慮敏感性，盡量避免漏檢，同時也要盡量避免假陰性存在。若監測出現部分gB抗體陽性，就要進行溯源，必要條件下進行AD-gE-ELISA試劑盒抗體驗證，甚至通過PCR以及免疫病理等進一步確診及驗證。

因此用于篩查預警的試劑盒在我國現場推廣應用過程中，必然會呈現抗體陽性率很高甚至極高情況出現。而陽性率和保護率是兩個不同的概念，陽性率不代表保護力也不代表保護率，因此部分豬群存在抗體陽性率高但保護率、保護力低下的現象，這也是造成這么多年豬偽狂犬病頻發、野毒gE抗體陽性率居高不下的一個原因和誤區。

眾所周知，豬偽狂犬病疫苗免疫后效果評價的黃金標準是中和抗體（VN）（豬瘟、口蹄疫等疫苗同樣如此），但該方法不易操作且較費時間，因此未被普遍采用。當前多采用操作簡便、快速、可用于大量樣本檢測的ELISA試劑盒。作為代替檢測方法，要求結果與中和抗體之間呈現良好的線性關系。

那么目前市售的進口、國產AD-gB-ELISA抗體試劑盒檢測數值與中和抗體是否呈線性關系（結果數值能否代表或反映中和抗體水平）、線性系數高低如何，我們通過購買強陽性已知中和抗體水平的高免標準血清（購自中監所）或豬場自制內控高免血清，對高免血清倍比稀釋為8-10份，采用不同廠家AD-gB-ELISA試劑盒對稀釋不同濃度的標準血清進行抗體檢測，將結果導入EXCEL表中制作線性圖表，進而清晰直觀呈現出不同廠家試劑盒檢測結果的線性關系。在進行對比實驗過程中，可以對每份稀釋好的標準血清平行檢測5次，進行重復性分析即穩定性分析。

具體案例如下：（南方區某中國養豬集團總部中心實驗室2020-12-20）

表1  強陽性血清不同試劑盒檢測結果

注：（1）集團總部實驗室自制內控高免血清，稀釋7份，加上原液共8份；

（2）四個廠家不同類型的gB-ELISA試劑盒，A型試劑盒為間接法（荷蘭）、B型為阻斷法（美國）、C型為阻斷法（法國）、D型為阻斷法（美國）；

（3）每個廠家試劑盒對每一份稀釋血清平行檢測2次、算出平均值和離散度即穩定性分析（僅作參考）。

圖1  抗體值與陽性血清濃度線性關系

注：（1）每種試劑盒單獨一個線性分析圖；

（2）橫坐標代表高免血清的稀釋倍數；

（3）縱坐標代表每種試劑盒檢測值。

圖2  不同廠家試劑盒檢測數據回歸方程

從表1、圖1、圖2可以得出以下分析，供大家參考：

（1）A試劑盒（荷蘭）所檢測的S/P值與中和抗體線性關系高達R2=0.9431，幾乎接近完美（R2=1代表完全線性關系），表明A型試劑盒所檢測的S/P值能夠真實差異化的評價疫苗免疫效果，因所檢測的S/P值與中和抗體有一一對應的線性關系；其它三種試劑盒與中和抗體的線性關系相對較差，尤其是C試劑盒（法國），線性關系最差，試劑盒檢測結果無法差異化評價血清抗體水平，即無法準確評價豬群疫苗免疫效果；

（2）從圖2中可看出，B試劑盒（美國）和D試劑盒（美國）在線性關系方面，兩者試劑盒無顯著差別，當中和抗體水平處于中低水平時（即稀釋倍數較高的階段，即24-27范圍），線性關系較好；當中和抗體水平處于中高水平時（稀釋倍數較低的階段，即20-23范圍），線性關系較差，幾乎成了一條平行線。即當豬群豬偽狂犬病疫苗免疫效果較差或一般時，用這兩個試劑盒所檢測的S/N值能夠反映疫苗免疫的真實效果（所檢測的S/N值與中和抗體呈現一一對應的線性關系），但當豬群豬偽狂犬病疫苗處于高效免疫的時候（即產生的中和抗體水平較高），則用這兩個試劑盒所檢測的S/N值很難反映疫苗的真實免疫效果。而C試劑盒更差，中和抗體處于低中高任何階段均不能真實呈現/代表/反映疫苗的免疫效果；

（3）當中和抗體水平處于中、高水平時（即稀釋倍數較低階段），B、C、D三個試劑盒所檢測的S/N值均較為聚集，尤其高中和抗體水平時，則聚集更為嚴重（所檢測的S/N值均在0.0~0.1范圍），顯示離散度非常低即均勻度非常高的一種假象，這就是阻斷型/競爭型ELISA抗體試劑盒掩蓋真實結果的“地板”現象，即到達一定水平時，再高的中和抗體所檢測的S/N值不再發生變化；而A試劑盒（荷蘭）因與中和抗體呈線性關系，所以檢測值相對均勻分散即離散度較高，可以反映真實結果；

（4）當一個國家、地區或豬場處于非免凈化豬偽狂犬病情況下，B/C/D三家gB-ELISA抗體試劑盒用作篩查（即預警）則是比較好的選擇，尤其C試劑盒更好（敏感性最強），而A型試劑盒用作篩查（即預警）用則稍遜色；

（5）在亞洲尤其中國，作為豬偽狂犬病疫苗免疫國家，基本不存在抗體陰性豬只，采用特定豬偽狂犬病gB抗體試劑盒所檢測的結果呈現陰性，實際上是一種假陰性（非真正抗體陰性豬），僅為母源抗體降低到一定滴度而疫苗的免疫抗體尚未升高到所用特定試劑盒可以檢測到的水平；

（6）每種ELISA抗體試劑盒均有Cut-off值（即陰陽分界線），但對豬偽狂犬病疫苗免疫國家而言，相對于分析Cut-off值，對于檢測結果的解讀方案則更加重要，即通過對所檢測的血清結果進行科學解讀，能夠說明豬群/豬只免疫效果好壞。

總之，豬偽狂犬病gB-ELISA抗體試劑盒的選擇較為復雜，雖然市售試劑盒廠家很多，目前只有間接、阻斷和競爭性ELISA三種方法，試劑盒質量及穩定性均沒有問題，關鍵是清楚檢測目后進行針對性選擇。通過上述大型集團中心實驗室比對結果表明，間接法AD-gB-ELISA抗體試劑盒更能客觀真實評價豬群豬偽狂犬病疫苗免疫效果。在進行試劑盒比對時，除比對試劑盒的穩定性、敏感性、特異性，更要考慮所選試劑盒能否對豬場疫苗免疫狀態進行真實評估和客觀反映！

參考文獻：

1. Arjan S tegeman. Aujeszky ’ s disease (pseudorabies) virus eradication campaign in the Netherlands. Veterinary Microbiology 55 ( 1997) 175- 180.

2. Arjan Stegeman (1995) Pseudorabies virus eradication by area‐wide vaccination is feasible, Veterinary Quarterly, 17:4, 150-156, DOI:10.1080/01652176.1995.9694556

3. Aujeszky’s Disease. Charpter 2.1.2.